polymerase chain reaction (PCR)

protocols
PCR
DNA
Published

October 14, 2024

Modified

November 10, 2024

聚合酶链式反应

试剂和仪器

试剂

  1. 热稳定DNA聚合酶（taq酶，-20℃）。
  2. 10×PCR扩增缓冲液。
  3. 25 mmol/L \(MgCl_2\)。
  4. 4种脱氧单核苷三磷酸（dNTPs）混合贮存液（20 mmol/L,pH=8.0,-20℃）
  5. 50×TAE缓冲液
  6. 阴性对照模板DNA
  7. 正向引物(F,20μmol/L)及反向引物(R,20μmol/L)溶于灭菌\(ddH_2O\)中
  8. EB（溴化乙锭）或荧光染料（Gel-Red）

仪器

  • PCR管(0.2mL)
  • PCR仪(Biolab,带热盖)

实验操作

  1. 引物设计
    1. primer：一小段与目的基因共享同源性的单链DNA
    2. fa
  2. 引物配置
    1. 分子量计算公式：\[分子量 =C\times288+A\times312+G\times328+T\times303-61 \]或者==\[近似分子量\approx 碱基数\times 324.5\]==
    2. 引物工作浓度5-10 μmol/L,10 ×，20bp，2.0\(OD_{260}\) \[1.0 OD_{260}=33\mu g Oligo DNA\] 终浓度为50μmol/L
    3. 计算：\[分子量=20\times 324.5=6490 g/mol\] \[质量数=2\times33=66\mu g\] \[物质的量=66{\div}6490=0.010μmol\] \[终体积=0.010{\div}50×10^6=200μL\]
    4. 离心机，\(ddH_2O\)溶解Oligo
  3. PCR反应组分
    1. 常规50μL反应体系：
      • 模板DNA1~500ng
      • 正向引物5~10ng
      • 反向引物5~10ng
      • 1×PCR缓冲液
      • \(MgCl_2\)
      • dNTPS混合液
      • Taq酶 1unit
    2. 以自制质粒DNA为模板的PCR反应：

      • 0.2mL PCR 管依次加入

        1. 10×PCR扩增缓冲液（含\(MgCl_2\)) 5μL
        2. 20mmol/L dNTPs混合液 1μL
        3. 5μmol/L正向引物 2.5μL
        4. 5μmol/L反向引物 2.5μL
        5. \(ddH_2O\) 37μL
        6. 模板质粒DNA 1μL
        7. 1~5U/μL Taq聚合酶 1U
        • 总体积 50μL
  4. 设置对照组实验
    1. 阳性对照：靶DNA片段
    2. 阴性对照：P154 正向/反向引物，有/无模板DNA，非特异性配对，污染
  5. PCR仪
    1. Denaturation 高温95℃变性
    2. Annealing 低温50~65℃，55℃退火
    3. Synthesis 中温72℃延伸
  6. 产物鉴定
    1. DNA凝胶电泳
    2. EB染色