Western Blot

protocols
protein
Published

September 24, 2024

Modified

November 10, 2024

蛋白质免疫印迹（protein immunoblot）

试剂和仪器 云端试剂档案

试剂

  1. PBS
  2. 高效RIPA裂解液
  3. WB及Co-Ip裂解液
  4. BCA法：A液，B液
  5. 5 × loading buffer
  6. 电泳缓冲液
  7. 转膜缓冲液：700ml \(ddH_2O\) ： 200ml 甲醇 ：100ml 10×转膜液
  8. 封闭液
  9. 1×TBST
  10. 一抗
  11. 二抗
  12. 一抗稀释液
  13. 二抗稀释液
  14. 显影液：A液，B液

仪器

  1. 恒温摇床

  2. 冷冻离心机 参数 转速 半径

  3. 96孔酶标板

实验操作

所有操作应于冰上/4℃ 进行

  1. 蛋白提取
    1. 洗涤细胞 细胞来源：动物信息、编号、性别、年龄、体重、清洁度、细胞株、基因信息
    2. 裂解
  2. 蛋白定量 样品所有人姓名，样品制备或分装年月日，全部基本信息（批号、纯度、浓度） 例如：AlexFluoro647-G3-(GfO)9,365 uM in ddH2O by UV@647nm,95%(MALDI),LY,2021.07.21
    1. 96孔板
    2. BCA，稀释10倍
    3. 恒温37℃孵育30min 具体：恒温孵育 9日11:34至12:05
    4. 酶标仪，ABS，562nm 具体：在562nm的紫外吸收（A1+A2+A3/3=A平均 ）
    5. 计算浓度
  3. 蛋白变性
    1. protein:5×loading buffer=4:1稀释
    2. 95℃加热5分钟
    3. 若是Co-IP，利用beads说明书
  4. 计算上样量
    1. \(\frac{上样量(μg)}{c×8}\)
  5. 电泳
    1. 预制胶，撕掉红色条膜
    2. 电泳液
    3. 恒压100-140V，60min
  6. 转膜
    1. 甲醇激活膜
    2. 凝胶水冲，转膜液激活，“黑胶”
    3. 转膜液平衡膜
    4. “白膜”
    5. 赶走气泡
    6. 恒流280mA，60-90min
  7. 封闭
    1. 5%奶粉TBST溶液
    2. 摇床50，1h
  8. 一抗孵育
    1. 一抗稀释液1：1000
    2. 摇床50，4℃ .pm~ .am,
    3. TBST洗涤，3min×3
  9. 二抗孵育
    1. 二抗稀释液1：4000~5000
    2. 摇床50，室温1h
    3. TBST洗涤，3min×3
  10. 显影
    1. 配制显影液
    2. 显影仪 电脑文件夹数据图像命名：姓名日期参数Marker/Samples 结果：具体数值/图像/现象/颜色

多用图表

WB
步骤 2024-11-12 2024-11-14 …… 2024-11-19
1.动物模型
2.细胞
3.蛋白提取
4.蛋白定量
……

成功的失败的、反思总结

重复、阴性对照

奇偶页法

左边写实验设计 假设 对照 原始数据 草图 现象

右边正式步骤 数据 分析

所有过程都务必记录