单细胞组学 Single cell omics

人体由约30万亿个细胞构成。

单细胞组学利用单细胞分离与分选技术、单细胞组测序技术及其生物信息学分析算法，开展高通量、多维度和大群体细胞学研究。包括单一细胞层级上的基因组学（genomics）、转录组学（transcriptomics）、蛋白组学（proteomics）、免疫组学、微生物组学和细胞间相互作用等的研究。

RNA quantification

基于全长（full-length）
基于标签（tag-based）

Barcode：长度可能在 10 - 20bp 左右。在一次实验中同时对 1000 个单细胞进行测序，就会有 1000 个不同的 Barcode，每个 Barcode 对应一个细胞。

Unique molecular identifiers (UMIs) ：。一般较短，约 6 - 12bp。在一个细胞中有 10 个相同 mRNA 分子，相同的 mRNA 可能会被多次反转录和扩增，通过 UMI 可以区分这些最初来自不同 mRNA 分子的相同序列。

dropout，doublet

捕获细胞数目和测序深度最佳权衡

引物

10× Genomics：Poly A
基于随机引物：snRandom-seq

单细胞分离技术

低通量

手动单细胞挑取
连续稀释
流式细胞术（Fluorescence-activated cell sorter，FACS）
激光捕获显微切割技术（laser capture microdissection，LCM）
显微操作（micromanipulation）

高通量 核酸捕获（capture）

微流控microfluidic：液滴droplet，“油包水”，事实标准，高通量，低成本
微孔板microwell

表达矩阵

单细胞分离：单细胞悬液
细胞标记：16bp 在细胞包入微液滴时，带有 Barcode 和 UMI 的寡核苷酸序列一同进入微滴，与细胞释放的 mRNA 分子杂交，之后在反转录过程中标签整合进 cDNA。后续测序和分析时，用 Barcode 区分不同细胞数据、用 UMI 精准定量细胞内基因表达。
核酸捕获：基于微滴，基于微孔板，磁珠捕获，基于组合索引
文库制备：PCR扩增或体外转录扩增
1. 退化寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR）
2. 多重链置换扩增技术MDA
3. 多重退火环状循环扩增技术MALBAC
4. 纯线性扩增技术LIANTI
高通量测序
1. plate-based protocols with UMIs：减轻了PCR扩增噪声的影响，如CEL-seq2、MARS-seq；
2. plate-based protocols with reads：覆盖转录本全长，如Smart-seq2；
3. droplet-based：如10X Genomics、in Drops和Drop-seq;
4. 组合索引：sci-RNA-seq
5. Cyto-seq，Seq-Well，Microwell-seq，
序列联配、
定量

测序数据→计数矩阵

Cellranger 10XGenomics/cellranger https://www.nature.com/articles/ncomms14049
alevin 伪对比方法. https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-019-1670-y
spike-in transcripts 将 spike-in sequences作为参考基因组的一部分

Session Information

Code

Sys.Date()
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BiocManager::version()
#> [1] '3.22'
devtools::session_info()
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#>  [1] E:/_GitHub/OmicsNotes/OmicsRenv/renv/library/windows/R-4.5/x86_64-w64-mingw32
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#> 
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